抗體發(fā)現(xiàn)中的單個B細胞技術
自FDA 1986年批準第一個單克隆抗體以來，目前已經(jīng)有超過100多個抗體被批準上市，用于治療病毒感染，腫瘤，自身免疫疾病，代謝性疾病，神經(jīng)疾病和器官移植等疾病，特別是在腫瘤治療領域，目前已經(jīng)有多種類型的抗體如scFvs，ADC，雙特異抗體等。從抗體發(fā)現(xiàn)方面來看，這些已經(jīng)批準的抗體主要來源于以下幾種技術：雜交瘤，噬菌體展示，酵母展示，人源化小鼠，單個B細胞技術，但究其本質，基本上所有抗體最終都是來自于B細胞（除了一些合成庫），因此如何高效的獲取特異性B細胞一直以來是抗體發(fā)現(xiàn)前進的方向。近日 Cell上發(fā)表了一篇名為Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery綜述對單個B細胞技術的發(fā)展進行了匯總。
文章基于B細胞的培養(yǎng)方式將這些技術分為兩大類，共6種：1）傳統(tǒng)的基于孔板（96或者384）或者玻片等大體積培養(yǎng)的技術，如雜交瘤，記憶B細胞或者ASC（antibody-secreting cells）培養(yǎng)技術及基于BCR的抗原染色技術；2）在微小體積中培養(yǎng)的技術，如Single B cell screening methodologies，B cell replica methodologies，Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification。
下表匯總了6種技術的優(yōu)缺點，傳統(tǒng)的雜交瘤在費用，親和力等方面具有一定優(yōu)勢，但是在耗時，通量及特殊抗體（一些特殊表位的抗體）方面有一定的難度；而一些比較成熟的B細胞分選技術各有優(yōu)缺點，這里不再詳細介紹。
雜交瘤
B細胞在體外存活時間較短，因此為鑒別分泌特定抗體的B細胞帶來了挑戰(zhàn)。為了延長B細胞的存活時間，研究者們開發(fā)了B細胞永生化技術，如將B細胞與骨髓瘤細胞融合或者用EBV病毒感染B細胞。
雜交瘤技術是我們熟知的一種B細胞永生化技術，它將能夠分泌抗體的B細胞ASCs與骨髓瘤細胞融合，使得ASCs能夠獲得瘤細胞無限繁殖的優(yōu)勢，并且在生長過程中將抗體分泌于培養(yǎng)傷情以供檢測篩選。最初的雜交瘤是小鼠脾細胞與骨髓瘤融合，但是后來有研究者相繼開發(fā)了骨髓，淋巴結和PBMC等組織細胞的融合技術，并且該技術也被推廣到了不同種屬如兔子等雜交瘤的制備。融合后利用HAT（次黃嘌呤，氨基碟呤和胸腺嘧啶）培養(yǎng)基進行篩選，排除沒有融合的B細胞或者骨髓瘤細胞。為了防止陽性克隆的丟失，一般在融合后的1-2周進行抗體特異性檢測，并進行亞克隆形成單克隆。
雜交瘤的缺點是，融合的效率相對較低，因此融合后會丟失很多特異性B細胞。另外，陰性B細胞形成的雜交瘤會與陽性雜交瘤競爭，可能會導致陽性雜交瘤的丟失。
記憶B細胞和ASC培養(yǎng)技術
得益于過去20年B細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，使得記憶型B細胞不必進行永生化也可以在化學成分確定的培養(yǎng)基中生長。通過特定方法將B細胞分選到96或者384孔板進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后既可以進行ELISA篩選也可以進行功能性篩選，如中和試驗等。該方法可以篩選到一些特殊功能的抗體，如廣譜中和抗體。HIV，SARS-CoV-1的一些廣譜中和抗體就是通過該方法篩選的。
另外，基于該培養(yǎng)方式，還可以通過半固體培養(yǎng)基，利用抗原包被磁珠，搭配熒光標記的二抗，篩選能夠分泌目標抗體的B細胞，該方法因為利用半固體培養(yǎng)基，因此無需物理上對B細胞進行分離，其篩選基數(shù)會更大。
基于BCR的技術的篩選
該篩選方法是基于記憶型B細胞表面的抗體（BCR），其主要是對抗原進行標記，如熒光標記，磁珠標記或者是核酸標記，然后利用這些標記的抗原對目標B細胞進行分離，如通過熒光進行FACS篩選。該方法在篩選中容易產(chǎn)生假陽性，因此實際篩選中經(jīng)常對抗原進行不同的標記，如雙熒光或者不同的Tag標簽等，進行交叉篩選排除非特異性結合的B細胞。
該技術是目前比較流行的篩選方法，因為其具有較高的通量，較低的成本并且簡便易操作。但是由于該方法是基于BCR篩選，因此只能篩選記憶型B細胞，而沒有BCR的一些B細胞無法被篩選到。
以上介紹的篩選技術都是基于常規(guī)的孔板或者微型玻片技術，但是隨著技術的更新和進步，目前出現(xiàn)了多種基于微流控的篩選技術，該技術使得單個B細胞可以在很小體積中培養(yǎng)，使得抗體的濃度很快達到檢測限度，因此其時間更短，通量更高。
Single B cell screening methodologies
根據(jù)篩選方式的不同，單個B細胞篩選技術可以分為兩大類：1）開放式的篩選方式，如Beacon，微流控室，微型雕刻系統(tǒng)和毛細管陣列；2）封閉式的篩選方法，這類篩選都是基于油包水的油珠，將B細胞和檢測實際封閉在一個絕對封閉的環(huán)境中（下圖）
Beacon技術將數(shù)千個單個ASCs或激活的記憶B細胞放置在定制的培養(yǎng)芯片上的NanoPen室（體積從740pl到1.7nl不等）。在此過程中，它們會在上清液中分泌抗體。為了檢測抗原特異性抗體，包有抗原的微球被放置在NanoPen的正上方，周圍有熒光標記的二級抗體。NanoPen室里，分泌的抗體與涂有抗原的微球結合，并被含有熒光二抗檢測。篩選階段通常只需要幾分鐘到幾小時，然后使用一種稱為光電子定位（OEP）的結構化光系統(tǒng)進行特定的單體B細胞檢索。
微流控室的篩選方法依賴于一個微型雕刻的聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架。包被相關抗原的微球被加入到含有單個B細胞的微室內，B細胞分泌的抗體與抗原結合，并被標記的熒光二抗結合，并通過熒光二抗定位目標抗體的B細胞。
另一種小型化技術包括一個微刻系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，0.1-1.0 nl體積的微室被印在PDMS芯片上，ASC通過有限稀釋法被分離到這些微室中。為了識別分泌目標抗體的單個ASCs，該系統(tǒng)使用一個預涂有抗原的PDMS/玻璃芯片，由分泌的抗體 "打印 "出來，然后用熒光標記的二抗檢測分泌的抗體?；蛘呤菍⒍拱辉赑DMS/玻璃芯片上，然后利用熒光標記的抗原檢測目標抗體，對于陽性的B細胞，其對應的芯片上會形成圓形的熒光信號。在這兩種情況下，都需要一個特殊的微操縱器來獲取目標B細胞。
與前面提到的方法相比，毛細管陣列可以檢測更高的通量，其通過將各種40μm的玻璃纖維組合在一起，而不是在PDMS芯片上印刷或雕刻這種方法可以篩選出數(shù)百萬個體B細胞。與之前的方法一樣，對于分泌有目的抗體的檢測是通過可移動的包被抗原的芯片進行。隨后的單個目標ASC通過毛細管中的氮氣進行分離。
在全封閉的檢測中，有一種基于微流控技術的系統(tǒng)，其中的水滴被嵌入油基介質中，形成油包水乳劑。這些不同的微流控系統(tǒng)的技術原理與微流控室系統(tǒng)相類似，因為它們也依賴于單一抗原特異性ASC分泌的抗體和一個包被抗原的微球，以及一個捕獲抗體的熒光二抗。這方面的一個例外Sphere Fluidics的Cyto-Mine技術，該技術通過共振能量轉移（FRET）信號來分析鑒定分泌目標抗體的單個ASC。該信號由一個用供體標記的可溶性抗原和一個用受體探針標記的抗IgG二抗，這樣抗原和二抗結合同一個抗體后形成能量共振轉移，并被檢測。
B cell replica methodologie
B細胞“復制”方法顛覆了傳統(tǒng)的篩選方法：目標B細胞的篩選首先提取RNA并進行VH-VL目的片段的逆轉錄，獲得目的序列后，將目的序列導入到細胞進行表達。B細胞“復制”方法技術路線如下圖所示，首先分離單個B細胞，然后裂解B細胞并進行逆轉錄構建自然配對的VH-VL庫，為了方便后續(xù)的展示，VH-VL在構建過程中加入了linker，構建完成的VH-VL被導入到完整的細胞，如哺乳動物細胞，酵母細胞或者噬菌體中進行展示篩選。該方法已經(jīng)被成功的用于流感病毒特異性抗體的篩選。
Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification
一種相當新穎的識別抗原特異性B細胞的方法是利用最近開發(fā)的單細胞轉錄組技術，如10xChromium或任何系統(tǒng)或任何使用攜帶條形碼的珠子的系統(tǒng)，如Drop-Seq。這一概念是基于這樣一個事實：在免疫或感染后，在所有擴增的克?。ㄗ匀慌鋵Φ腣H-VL獨特的同源組合）中，抗原特異性B細胞的流行率高。使用傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術將無法直接傳遞本地抗原特異性單克隆抗體的遺傳信息，因為這些技術無法檢索到天然配對的單個VH-VL序列。雖然傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術有一定的缺陷，但是有研究者使用B細胞測序數(shù)據(jù)（不是天然配對的VH-VL序列），通過分析克隆擴增、高頻克隆和突變負荷等特性，已經(jīng)證明免疫或感染后，抗原特異性克隆會擴增并進行高頻突變。這一概念進一步發(fā)展，并且有研究者根據(jù)這一概念首次篩選了針對埃博拉病毒的單克隆抗體盤。該抗體盤的建立是通過對免疫埃博拉病毒VLP的BALB/c小鼠中的擴增頻率最高的克隆進行分析，并利用PDMS芯片分選技術對B細胞逆轉錄獲得天然配對的VH-VL序列。最終選取擴增最多的VH-VL序列，然后進行合成，克隆到合適的哺乳動物表達載體中，并以重組形式表達，以證實其抗原特異性。
總結
雖然B細胞分選技術已經(jīng)取得了巨大的進步，但是基于雜交瘤的分選技術目前還是主流，這主要是該技術簡單，方便，而且成本較低，不需要昂貴的儀器。相比較而言，新型的技術大多需要特定的儀器，而且技術比較難以掌握，成本高昂。但是，新技術是發(fā)展使過去一些比較難以篩選的抗體成為可能，如針對GPCR，離子通道，胞內抗原的抗體的篩選。另外，過去的幾年，AI技術在蛋白結構預測方面取得了巨大進步，其在抗體，抗原相互作用預測方面將有較大的幫助，并且可能更好的指導抗體的改造，但是在抗體發(fā)現(xiàn)方面，單個B細胞技術還是主要的手段。
參考文獻
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